Dlaczego AMR stanowi globalne wyzwanie?
Oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) stanowi rosnące zagrożenie dla zdrowia publicznego na całym świecie, przypominając powolną pandemię. Antybiotyki β-laktamowe, w tym penicyliny, cefalosporyny i szczególnie istotne karbapenemy, są podstawą chemioterapii przeciwdrobnoustrojowej, jednak ich skuteczność systematycznie maleje. Klinicznie istotne patogeny Gram-ujemne, takie jak oporne na karbapenemy szczepy Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa i Enterobacter spp. (zaliczane do tzw. “patogenów ESKAPE”), rozwinęły wysoką oporność na większość dostępnych leków przeciwbakteryjnych, skutecznie unikając działania bójczego antybiotyków.
Sytuacja jest niepokojąca, ponieważ obecne szacunki wskazują, że AMR, odpowiadająca już za ponad 1,2 miliona zgonów rocznie na całym świecie, może stać się główną przyczyną śmierci w 2050 roku (10 milionów zgonów rocznie), zagrażając wynikom nawet najprostszych procedur medycznych. Pandemia COVID-19 dodatkowo pogorszyła tę sytuację, ponieważ pacjenci z COVID-19 są rutynowo leczeni antybiotykami o szerokim spektrum działania, w tym cefalosporynami o rozszerzonym spektrum (np. ceftriakson, ceftazydym i cefepim), chinolonami i karbapenemami. Warto zauważyć, że u pacjentów z COVID-19 na oddziałach intensywnej terapii zgłaszano zakażenia opornymi na antybiotyki szczepami Staphylococcus aureus, K. pneumoniae, P. aeruginosa czy A. baumannii. Pojawienie się mobilnej oporności na kolistynę-1 w 2015 roku oraz transferowalnych genów oporności na tygecyklinę w 2019 roku, które warunkują oporność odpowiednio na kolistynę i tygecyklinę, oznacza, że skuteczność wszystkich klinicznie istotnych antybiotyków stosowanych w poważnych zakażeniach Gram-ujemnych jest zagrożona, przy czym cefiderokol pozostaje antybiotykiem ostatniej szansy.
Jakie mechanizmy skrywają się za opornością na karbapenemy?
Oporność na karbapenemy wśród bakterii Gram-ujemnych wynika głównie z wytwarzania jednej lub więcej karbapenemaz, które inaktywują te ratujące życie leki. Enzymy te są często kodowane przez plazmidy, które łatwo przenoszą się między szczepami. Bakterie osiągają te trudne reakcje chemiczne za pomocą dwóch rodzin enzymów hydrolitycznych: β-laktamaz serynowych (SBL) wykorzystujących katalityczną resztę serynową oraz metallo-β-laktamaz (MBL) wykorzystujących jeden lub dwa jony cynku do katalizy. Zwiększona częstość występowania karbapenemaz serynowych i MBL sprawia, że antybiotyki β-laktamowe stają się coraz mniej skuteczne w leczeniu zakażeń wywołanych przez wielolekooporne/ekstremalnie lekooporne (MDR/XDR) izolaty Gram-ujemne.
MBL są szczególnie interesujące i niepokojące ze względu na kilka czynników: (i) zdolność do hydrolizy i zapewnienia oporności na praktycznie wszystkie antybiotyki β-laktamowe (z wyjątkiem monobaktamów); (ii) brak dostępnych klinicznie inhibitorów MBL; (iii) szybkie tempo, w jakim izolowane są nowe warianty; (iv) transferowalność genów je kodujących oraz (v) ich wszechobecność, ponieważ zostały zidentyfikowane zarówno w szczepach szpitalnych, jak i środowiskowych.
MBL należą do trzech podklas (B1, B2 i B3), głównie na podstawie zawartości metalu i różnych cech miejsca aktywnego. Geny β-laktamaz kodujące MBL podklasy B1 są w dużej mierze przenoszone przez plazmidy i mają większe znaczenie kliniczne w porównaniu z enzymami podklasy B2 i B3. Imipenemaza (IMP), metallo-karbapenemaza kodowana przez integrony Verona (VIM) oraz metallo-β-laktamaza New Delhi (NDM) są trzema najczęściej występującymi MBL w izolatach klinicznych i należą do podklasy B1. Warto zauważyć, że enzymy typu NDM są obecnie dominującymi MBL w Europie. Mikroorganizmy wytwarzające NDM mogą powodować zagrażające życiu infekcje, dlatego aktywne rozprzestrzenianie się tych mikroorganizmów poza systemem opieki zdrowotnej budzi obawy.
Kluczowe fakty o AMR i MBL:
- AMR odpowiada obecnie za ponad 1,2 miliona zgonów rocznie na świecie
- Prognozuje się wzrost do 10 milionów zgonów rocznie do 2050 roku
- Najważniejsze typy MBL to:
– IMP (Imipenemaza)
– VIM (metallo-karbapenemaza kodowana przez integrony Verona)
– NDM (metallo-β-laktamaza New Delhi) - Brak dostępnych klinicznie inhibitorów MBL stanowi pilną potrzebę medyczną
Czy klasyczne inhibitory wystarczą w walce z MBL?
Osiem związków zostało zatwierdzonych na przestrzeni lat jako inhibitory SBL do stosowania w różnych kombinacjach z antybiotykami, przy czym enmetazobaktam i durlobaktam są ostatnim dodatkiem do arsenału. Jednak żaden z tych inhibitorów nie wykazuje aktywności przeciwko szczepom wytwarzającym MBL. Kombinacje z inhibitorami MBL są obecnie niedostępne do użytku klinicznego, dlatego opracowanie inhibitorów MBL o szerokim spektrum działania, zdolnych do przywrócenia skuteczności istniejących antybiotyków, stanowi niezwykle pilną potrzebę medyczną.
Chociaż ostatnio zaproponowano różne szablony chemiczne jako inhibitory MBL, słabe podobieństwo sekwencji między różnymi członkami, problemy z selektywnością wobec ludzkich metaloenzymów oraz obecność płytkich miejsc aktywnych stanowią istotną przeszkodę w opracowaniu bezpiecznych i skutecznych inhibitorów MBL o szerokim spektrum działania. W tym kontekście warto wspomnieć o taniborbaktamie, inhibitorze boronianowym o szerokim spektrum działania, opracowanym w połączeniu z cefepimem, który zakończył badania kliniczne fazy 3 w 2022 roku, oraz o kseruborbaktamie (QPX7728), dostępnym doustnie inhibitorze o podobnym rusztowcu, który zakończył badania kliniczne fazy 1 w połączeniu z β-laktamem QPX2014.
Jak skonstruować nowe inhibitory inspirowane kaptoprilem?
Zgodnie z ustaloną praktyką odkrywania leków, oprócz projektowania de novo nowych związków chemicznych działających jako inhibitory MBL, testowano również zatwierdzone leki pod kątem ich potencjału hamującego wobec tych metaloenzymów. W związku z tym L-kaptopril (1) i D-kaptopril (2) zostały ujawnione jako inhibitory NDM-1, z raportowanymi wartościami IC50 = 202 μM i 21,8 μM oraz Ki = 39 i 1,3 μM, odpowiednio. Rozwiązano strukturę kokryształu 1 w kompleksie z NDM-1 (PDB: 4EXS), co pozwoliło określić sposób wiązania i kluczowe interakcje w miejscu aktywnym enzymu. Nowsze dowody wykazały również, że inne zatwierdzone leki oparte na tiolach, a mianowicie tiorfan (3), dimerkaprol (4) i tiopronina (5), zachowują się jako mikromolowe inhibitory MBL w swoich formach racemicznych, a kokrystalizacja w NDM-1 potwierdziła sposób wiązania nakładający się na ten wykazywany przez kaptopril; jednak żaden z tych związków nie wykazuje profilu hamującego o szerokim spektrum i istotnej aktywności synergistycznej w połączeniu z antybiotykami β-laktamowymi.
Potencjał kaptoprilu o szerokim spektrum działania na inne MBL należące do klasy B1 został udowodniony przez dalsze struktury krystaliczne, w tym VIM-2 (PDB: 4C1D) i IMP-1 (PDB: 4C1F), chociaż reszty oddziałujące z grupą karboksylową różnią się w zależności od odpowiedniego MBL i absolutnej konfiguracji grupy karboksylowej inhibitorów.
Chociaż ostatnio ujawniono dużą liczbę związków opartych na tiolach, wykazujących umiarkowaną do dobrej aktywność hamującą in vitro, większość z nich nie posiadała aktywności o szerokim spektrum lub była oceniana tylko na niewielkiej liczbie izoform MBL. Ponadto obiecujące inhibitory nie przeszły lub nie zostały ocenione na klinicznie istotnych izolatach.
Jakie nowatorskie techniki syntezy umożliwiają efektywną produkcję związków?
Celem niniejszego badania było zbadanie inspirowanych kaptoprilem inhibitorów MBL opartych na tiolach. W szczególności zastosowaliśmy protokół reakcji wieloskładnikowej w celu szybkiego dostarczenia, w jednym naczyniu, związków opartych na indolinie, racjonalnie zaprojektowanych do odtworzenia sposobu wiązania kaptoprilu w miejscu aktywnym MBL, przy jednoczesnym zwiększeniu wzoru interakcji hydrofobowych. Aby uzyskać dalszy wgląd w interakcje związków, zbadaliśmy również różne wyniki stereochemiczne w pozycji 2 rdzenia indoliny (związki 6a-f). Otrzymaliśmy również mały podzbiór związków o połączonym projekcie inhibitora, tj. z fragmentem tiorfanu osadzonym w naszej nowo zaprojektowanej strukturze opartej na indolinie (związki 7a-d).
Ponadto ogólna wydajność i zrównoważony charakter naszej opracowanej procedury chemicznej zostały dodatkowo zwiększone poprzez wdrożenie protokołu przepływu teleskopowego do syntezy głównego rdzenia związków. Wreszcie, w celu walidacji naszego podejścia i potencjalnej użyteczności tych nowych motywów strukturalnych, aktywność hamująca tych oryginalnych związków na istotne MBL (NDM-1, VIM-1, VIM-2, IMP-1 i IMP-7) została zbadana metodami biochemicznymi, podczas gdy ich sposób wiązania został zracjonalizowany poprzez badania dokowania. Ich aktywność synergistyczna z karbapenemami została również oceniona na izolatach klinicznych produkujących MBL.
Ogólnym celem naszej pracy było racjonalne projektowanie i synteza pochodnych inspirowanych lekiem kaptopril jako potencjalnych inhibitorów MBL o szerokim spektrum działania. Kaptopril wykazał aktywność w zakresie mikromolarnym wobec różnych izoform MBL. Nasza praca skupiła się na syntezie pochodnych heterocyklicznych w celu (i) uzyskania związków o ulepszonym profilu aktywności hamującej przeciwko MBL w porównaniu do kaptoprilu, przy jednoczesnym zachowaniu profilu o szerokim spektrum; (ii) przekształcenia struktury kaptoprilu w taki sposób, aby zminimalizować obecność grup funkcyjnych związanych z jego pierwotną aktywnością farmakologiczną (hamowanie ACE-1, enzymu konwertującego angiotensynę) i interakcją z podobnymi celami ludzkimi; (iii) wdrożenia protokołów syntetycznych ukierunkowanych na różnorodność, dających łatwy dostęp do przyszłej rozszerzonej eksploracji SAR; (iv) zastosowania zrównoważonych i korzystnych ciągłych metodologii chemicznych przepływowych.
Najważniejsze osiągnięcia badawcze:
- Opracowano nową serię związków opartych na indolinie inspirowanych kaptoprilem
- Związki 6c-f wykazały:
– Szerokie spektrum hamowania różnych typów MBL
– Brak aktywności hamującej wobec ACE-1
– Lepszą aktywność niż związek referencyjny (D-kaptopril) - Związek 6d wykazał znaczącą synergię z imipenemem w testach na izolatach klinicznych
- Wdrożono zrównoważone i wydajne metody syntezy w przepływie ciągłym
Czy nowe związki skutecznie hamują MBL?
Racjonalne projektowanie cząsteczek skupiło się najpierw na enzymie NDM-1, ponieważ aktywność obu izomerów kaptoprilu jest dobrze opisana na tej specyficznej MBL. Zaprojektowane cząsteczki, oprócz zachowania części tiolowej niezbędnej do interakcji z kationami cynku w miejscu aktywnym enzymu, zostały również zaprojektowane w celu maksymalizacji interakcji w kieszeni miejsca aktywnego, ze szczególnym uwzględnieniem wiązań wodorowych i interakcji hydrofobowych.
W związkach należących do podseryi 1, wbudowaliśmy strukturę kaptoprilu w ramę indoliny. Zgodnie z naszą prognozą, system indoliny, poprzez fuzję układu aromatycznego z pierścieniem pirolidyny kaptoprilu, mógłby pozwolić naszym inhibitorom na ustanowienie dodatkowych interakcji π-π lub hydrofobowych w miejscu aktywnym enzymu, w tym dobrze zachowanych reszt w różnych podtypach MBL, takich jak Trp87. Druga modyfikacja strukturalna, mająca na celu zwiększenie kontaktów hydrofobowych w miejscu aktywnym, została przeprowadzona w pozycji 3 pierścienia indoliny, w której badano skuteczność albo połączenia spirocykloheksylowego, albo wstawienia grup 3,3-dimetylowych lub 3,3-dietylowych. Wreszcie, funkcjonalność α-karboksylowa podstruktury proliny kaptoprilu została zastąpiona fragmentem karboksamidowym, zachowując potencjał wiązania wodorowego w aktywnym MBL, jednocześnie ograniczając potencjalny problem związany z wieloma pochodnymi karboksylowymi kaptoprilu, które, choć w mniejszym stopniu, mogą zachowywać się jako inhibitory enzymu ACE-1.
Następnie zaprojektowaliśmy i zsyntetyzowaliśmy inną małą podserię związków, uzyskanych z podejścia łączącego. W związku z tym postanowiliśmy sprawdzić, czy wprowadzenie części strukturalnej należącej do tiorfanu (3) mogłoby być funkcjonalne dla uzyskania nowych inhibitorów NDM-1. W szczególności funkcjonalność 2-karboksamidowa została zastąpiona fragmentem amidu glicylowego tiorfanu.
Synteza końcowych związków 6a-d została przeprowadzona według opracowanego protokołu. Indoleniny 3,3-dipodstawione 10a-c uzyskano w wyniku przerwanej reakcji indolizacji Fischera między odpowiednimi dipodstawionymi α,α’-karbaldehydami 9a-c a chlorowodorkiem fenylohydrazyny 8 w obecności kwasu octowego pełniącego podwójną rolę rozpuszczalnika i katalizatora kwasowego. Indoleniny 10a-c poddano następnie wieloskładnikowej reakcji Joullié-Ugi w obecności izocyjanku tritylu 11, przygotowanego zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, oraz kwasu (S)-3-(acetylotio)-2-metylopropanowego 12 (fragment obecny w łańcuchu bocznym kaptoprilu), używając dichlorometanu jako rozpuszczalnika pod ciśnieniem w 50°C. Reakcje mieszano przez 12 godzin w 50°C. Etap wieloskładnikowy dostarczył związki 13a-c w postaci mieszanin diastereoizomerycznych w przybliżeniu 1:1 dr (określonych przez analizę HPLC i NMR). Deprotekcja grupy tritylowej przeprowadzona na izolowanych diastereoizomerach (rozdzielonych przez HPLC z odwróconą fazą) w obecności kwasu trifluorooctowego w dichlorometanie w temperaturze pokojowej dostarczyła odpowiednie pierwszorzędowe amidy 14a-c. Absolutna stereochemia związku 14b została zweryfikowana za pomocą spektroskopii CD. Końcowa hydroliza tioestrów z 2 N wodorotlenkiem sodu w tetrahydrofuranie prowadziła do końcowych wolnych tioli 6a-f.
Warto zauważyć, że hydroliza tioestrów wymagała starannego dostrojenia, aby uniknąć problemu epimeryzacji. W szczególności, gdy przeprowadzano ją przez ponad 12 godzin w temperaturze pokojowej, reakcja prowadziła do istotnej epimeryzacji w pozycji 2 rdzenia indoliny. Zadowalająco, gdy czas reakcji został skrócony do 2 godzin, hydroliza była kompletna, a integralność stereochemiczna została w pełni zachowana (<2% epimeryzacji według analizy NMR).
Aby opracować powtarzalne, wydajne i potencjalnie bardziej zrównoważone warunki reakcji do syntezy naszych związków, opracowaliśmy procedurę przepływową do syntezy reprezentatywnej pochodnej 13c. Wieloskładnikową reakcję Joullié-Ugi przeprowadzono w przepływie ciągłym, zastępując dichlorometan etanolem, zielonym rozpuszczalnikiem. W ten sposób przygotowano ekwimolarny roztwór spiroindoleniny 10c, kwasu 12 i izocyjanku tritylu 11 w etanolu (1 ml całkowitej objętości) i wstrzyknięto do pętli próbki. W naszym poprzednim badaniu zoptymalizowaliśmy wieloskładnikową reakcję przepływową, dostarczając izocyjanek i kwas karboksylowy przez oddzielne strumienie, aby zapobiec przedwczesnym reakcjom ubocznym i zwiększyć wydajność i selektywność. Roztwór został wstrzyknięty do systemu przepływowego, a pompowanie odbywało się przy przepływie 0,2 ml/min, w temperaturze 50°C i ciśnieniu 7 barów, w reaktorze rurowym o pojemności 15 ml. Całkowity czas przebywania w celu uzyskania kluczowego pośrednika 13c wynosił 75 minut, w porównaniu do 720 minut (12 godzin) wymaganych w trybie wsadowym.
Ponadto, mając już opracowaną procedurę w trybie teleskopowym łączącą przerwaną reakcję Fischera z następną wieloskładnikową reakcją Joullié-Ugi na powstałych indoleninach, zastosowaliśmy metodę do otrzymania kluczowych pośredników 13a-c i 16a-b, osiągając porównywalne wydajności w ciągu dwóch etapów w porównaniu do syntezy wsadowej, ale unikając w tym przypadku izolacji metastabilnych pośredników spiroindoleninowych i oszczędzając 95% czasu wsadowego. Opracowana zrównoważona metodologia pozwoli na łatwą eksplorację zależności struktura-aktywność i dalszą dywersyfikację strukturalną w zrównoważony sposób.
Jakie są molekularne podstawy działania inhibitorów MBL?
Aktywność hamująca związków została najpierw oceniona na panelu klinicznie istotnych MBL, w tym, oprócz NDM-1, innych MBL podklasy B1 (VIM-1, VIM-2, IMP-1 i IMP-7), aby lepiej ocenić ich spektrum hamowania. Wartości IC50 zostały określone w kinetycznym teście fluorescencyjnym in vitro zgodnie z wcześniejszym opisem. Wszystkie związki były preinkubowane z rekombinowanym białkiem przez 30 minut przed dodaniem fluorogennego substratu fluorocyliny. Aktywność hamująca została również określona (wyrażona jako procent hamowania w obecności 50 μM związku) przy użyciu testu spektrofotometrycznego, w którym monitorowano hydrolizę imipenemu (substratu reporterowego).
Z tych wyników można wyciągnąć kilka wniosków: (a) związki 14b,c, wykazujące chronioną grupę tiolową w postaci jej pochodnej tioestrowej, były raczej oczekiwanie nieaktywne lub bardzo słabo aktywne; (b) związki 7a-d, w których funkcjonalność pierwszorzędowego karboksamidu w pozycji 2 została zastąpiona amidem glicylowym obecnym w tiorfanie (3), są ogólnie mniej aktywne (do 10-krotnej utraty aktywności hamującej) niż ich odpowiednie analogi 2-karboksamidowe; (c) związki z wolną grupą tiolową i niepodstawionym 2-karboksamidem zapewniły najlepsze inhibitory, niektóre z nich wykazały lepszą aktywność niż związek referencyjny D-kaptopril (2). Co ciekawe, orientacja karboksamidu indoliny i charakter hydrofobowego podstawnika 3 (dimetylowy, dietylowy lub cykloheksylowy) nie wydają się mieć większego wpływu na aktywność, sugerując, że nie ma specyficznej interakcji z enzymem. Godne uwagi jest, że związki 6b-f są najbardziej potężnymi i interesującymi związkami wykazującymi niezwykle szerokie spektrum hamowania. W szczególności zaobserwowano znaczące hamowanie enzymów typu IMP, uważanych za raczej strukturalnie rozbieżne (pod względem cech miejsca aktywnego, a bardziej szczegółowo charakteru reszt obecnych w pętli L3 w pozycjach 61, 64, 67 i 87) od enzymów typu NDM i VIM.
Biorąc pod uwagę te pierwotne wyniki, najbardziej obiecujące związki (6c-f) zostały wybrane do dalszych badań, a wartości Ki zostały zmierzone dla NMD-1, VIM-2 i IMP-1. Związek 6b nie był dalej badany, ponieważ wykazywał niższą stabilność chemiczną w porównaniu do innych związków w serii.
Co ciekawe, do 30-krotnie niższe wartości Ki zmierzono z VIM-2, mimo że te związki zostały początkowo zaprojektowane do celowania w NDM-1. Związki 6c i 6e zostały potwierdzone jako hamujące trzy rozbieżne podtypy enzymatyczne testowane, potwierdzając raczej szerokie spektrum aktywności tych związków. W testach kinetycznych związki wydają się szybko hamować zarówno NDM-1, jak i IMP-1 (równowaga została ustanowiona w czasie mieszania), ale zaobserwowano inne zachowanie z VIM-2. Rzeczywiście, używając bezpośredniego testu konkurencyjnego, zaobserwowano zależne od czasu hamowanie enzymu ze związkami 6d i 6f, pozwalając na zmierzenie pseudo-pierwszorzędowej szybkości inaktywacji (kinakt). Analiza zależności kinakt od stężenia inhibitora pozwoliła na określenie stałych szybkości charakteryzujących interakcję inhibitor-VIM-2.
Ponadto, aby ocenić jeden z głównych celów tego badania, tj. przekierowanie aktywności analogów kaptoprilu z ACE-1 na MBL, aktywność hamująca związków 6c-e, spośród najbardziej potężnych inhibitorów MBL serii, została również oceniona na enzymie ACE-1. Uderzająco, te związki, w tym analogi zarówno L- jak i D-kaptoprilu, nie wykazały żadnej aktywności hamującej na ACE-1, nawet gdy testowano je w wysokim stężeniu (<5% hamowania przy 50 μM), podczas gdy kilka preparatów kaptoprilu (czyste izomery i mieszanina racemiczna) dało oczekiwaną aktywność hamującą.
Gdy oceniano aktywność synergistyczną w połączeniu z imipenemem na panelu izolatów klinicznych produkujących MBL, związek 6d wykazał znaczące 4-krotne zmniejszenie MIC imipenemu w izolacie K. pneumoniae produkującym VIM-1 i w izolacie P. aeruginosa produkującym IMP-1.
Test hamowania wzrostu w połączeniu z imipenemem wykazał, że związek 6d był w stanie przedłużyć potencjał hamujący imipenemu o kilka godzin. Zebrane razem, dane te podkreślają obiecujący potencjał 6d i skłaniają do dalszej kampanii optymalizacyjnej w celu poprawy profilu przenikania komórkowego tej nowej klasy inhibitorów MBL o szerokim spektrum działania.
W celu wyjaśnienia i odsłonięcia interakcji związków na poziomie molekularnym, możliwy sposób wiązania wybranych inhibitorów, a mianowicie 6c, 6d i 6e, z miejscem katalitycznym wybranych MBL typu NDM-, VIM- i IMP- został wyjaśniony przez szczegółowe badania obliczeniowe. Ogólnie rzecz biorąc, symulacje dokowania w połączeniu z dynamiką molekularną dostarczyły szczegółowego obrazu interakcji między najlepiej działającymi związkami serii a wariantami docelowymi MBL, co utoruje drogę do dalszej optymalizacji. Przyszłe działania mające na celu poprawę siły działania i rozszerzenie spektrum hamowania dla tych nowo zaprojektowanych inhibitorów MBL inspirowanych kaptoprilem będą obejmować racjonalną, krokową modyfikację lub zastąpienie oryginalnego łańcucha bocznego kaptoprilu, a także eksploracje charakteru i długości fragmentu amidowego serii podobnych do tiorfanu.
Podsumowanie
Artykuł przedstawia szczegółową analizę problemu oporności na antybiotyki (AMR) i rozwój nowych inhibitorów metallo-β-laktamaz (MBL). Oporność na karbapenemy stanowi rosnące zagrożenie dla zdrowia publicznego, z szacowaną liczbą 1,2 miliona zgonów rocznie. Badacze skupili się na opracowaniu nowych związków inspirowanych kaptoprilem jako potencjalnych inhibitorów MBL o szerokim spektrum działania. Wykorzystując innowacyjne techniki syntezy, w tym protokół reakcji wieloskładnikowej i metodologię przepływu teleskopowego, stworzono serię związków opartych na indolinie. Najbardziej obiecujące związki (szczególnie 6c-f) wykazały znaczącą aktywność hamującą wobec różnych typów MBL, przewyższając w niektórych przypadkach związek referencyjny D-kaptopril. Co istotne, nowe związki nie wykazywały aktywności hamującej wobec enzymu ACE-1, co było jednym z głównych celów badania. Związek 6d pokazał szczególnie obiecujące wyniki w testach synergistycznych z imipenemem na izolatach klinicznych.
