Przełom w leczeniu raka piersi: nowa pochodna kaptoprilu nadzieją dla pacjentów

Czym charakteryzuje się rak piersi?

Rak piersi w 2020 roku wyprzedził raka płuc pod względem liczby nowo zdiagnozowanych przypadków na całym świecie. Choroba ta charakteryzuje się wysoką heterogennością z różnymi podtypami klasyfikowanymi na różnych podstawach. Pod względem molekularnym, w zależności od ekspresji genów receptora estrogenowego (ER), progesteronowego (PR) i naskórkowego czynnika wzrostu 2, wyróżnia się: luminalny A ((ER i/lub PR)+, HER2-), luminalny B ((ER i/lub PR)+, HER2±), z nadekspresją HER2 ((ER/PR)-, HER2+) oraz bazalny (potrójnie ujemny) TNBC ((ER/PR)-, HER2-).

Na przestrzeni lat opracowano wiele terapii do leczenia wszystkich typów raka piersi, jednak prawie wszystkie z nich wiążą się z takimi samymi wyzwaniami dotyczącymi skutków ubocznych i oporności. Dodatkowo, najbardziej agresywny, z najgorszym rokowaniem TNBC nadal nie posiada znormalizowanego skutecznego leczenia. W związku z tym poszukiwanie nowych podejść wydaje się stale potrzebne, a jednym z nich jest układ renina-angiotensyna (RAS), który jest zaangażowany w prawie wszystkie cechy charakterystyczne nowotworów, w tym raka piersi. Co więcej, w ostatnim czasie zwrócono uwagę na rolę inhibitorów enzymu konwertującego angiotensynę (ACEi) i blokerów receptora angiotensyny II typu 1 (ARB) w onkologii jako potencjalnych środków chemoprewencyjnych, wspomagających, a nawet przeciwnowotworowych.

Czy kaptoprilowe pochodne to przepis na lepszą terapię raka piersi?

Kaptopril, pierwszy przedstawiciel rodziny ACEi z charakterystyczną grupą sulfhydrylową, był jednym z tych, które badano pod kątem potencjalnej roli w leczeniu raka piersi, z pozytywnymi wynikami. Niedawno Al-Saad i współpracownicy (2019) zsyntetyzowali nowe pochodne kaptoprilu, które wykazały wyższą aktywność przeciwpłytkową i hamowanie ACE niż ich związek macierzysty. Autorzy uzasadnili poprawę włączeniem fragmentu tiosemikarbazydowego, który zastąpił grupę karboksylową kaptoprilu z zachowaniem charakterystycznej grupy tiolowej.

Warto wspomnieć, że pochodne tiosemikarbazydowe/tiosemikarbazonowe wykazują aktywność biologiczną przeciwko różnym typom nowotworów. Uważa się, że związki te wywołują swoje działanie przeciwnowotworowe poprzez hamowanie wielu enzymów i istotnych celów cyklu komórkowego, w tym reduktazy difosforanu rybonukleotydów (RNR), tubuliny-kolchicyny i receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) kinazy tyrozynowej oraz topoizomerazy II.

Godna uwagi aktywność przeciwnowotworowa tych pochodnych została udokumentowana przez wiele badań zarówno w liniach komórkowych raka piersi z dodatnim, jak i ujemnym receptorem hormonalnym. W linii komórkowej raka piersi z dodatnim receptorem hormonalnym (MCF-7), Malki i jego współpracownicy (2015) wykazali działanie przeciwnowotworowe jednej z ich nowych pochodnych tiosemikarbazydowych (4c) poprzez celowanie w szlak sygnałowy JNK. Inne badania badały aktywność przeciwnowotworową tych pochodnych w komórkach raka piersi z ujemnymi receptorami hormonalnymi poprzez celowanie w różne cele komórkowe.

Biorąc pod uwagę zaangażowanie RAS w raku piersi i działanie przeciwnowotworowe zarówno kaptoprilu, jak i tiosemikarbazydów, w niniejszej pracy zbadano trzy pochodne tiosemikarbazydowe kaptoprilu oznaczone jako (5, 7 i 8) w dwóch typach linii komórkowych raka piersi: z dodatnim receptorem estrogenowym MCF-7 i agresywnym z ujemnym receptorem estrogenowym/progesteronowym AMJ13. Pochodne badano również na transformowanej nietumorogennej linii komórek piersi HBL-100.

Jak pochodne kaptoprilu wpływają na komórki raka?

Badania cytotoksyczności wykazały, że pochodna tiosemikarbazydowa (8) ma najlepszy profil antyproliferacyjny w porównaniu z innymi pochodnymi (5 i 7) oraz ich związkiem macierzystym kaptoprilem. Pochodna (8) silnie hamowała wzrost z IC₅₀ wynoszącym 88,06 µM i 66,82 µM odpowiednio w komórkach raka piersi MCF-7 i AMJ13, z mniejszym wpływem (153,3 µM) na transformowane nietumorogenne komórki piersi HBL-100. W porównaniu do kaptoprilu, który wykazywał IC₅₀ wynoszące 849,8 µM i 1075 µM odpowiednio w MCF7 i AMJ13, bez wpływu na nietumorogenne komórki piersi (HBL-100). Z drugiej strony, pochodna (5) wykazała poprawioną cytotoksyczność tylko wobec komórek raka piersi AMJ13 z IC₅₀ wynoszącym 96,28 µM, z mniejszym wpływem zarówno na MCF-7 (256,6 µM), jak i HBL-100 (204 µM). Natomiast pochodna (7) nie wykazała efektu hamującego na żadnej z trzech linii komórkowych.

Wyniki badań morfologicznych z wykorzystaniem barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) wykazały, że komórki MCF-7 po ekspozycji na pochodną (8) demonstrowały głównie cechy apoptotyczne charakteryzujące się obkurczeniem komórek i utratą pozycji organelli, powodując liczne nieprzezroczyste ogniska z niewielką degeneracją wakuolową. AMJ13 wykazywały natomiast wzór zanikowy z rozległą degeneracją wakuolową i niektórymi komórkami pozbawionymi cytoplazmy.

Jakie mechanizmy komórkowe leżą u podstaw działania pochodnych?

Barwienie oranżem akrydynowym/bromkiem etydyny (AO/EtBr) zostało wykorzystane do ilościowej i jakościowej detekcji ciałek apoptotycznych indukowanych przez pochodną (8). W linii komórkowej MCF7 zarejestrowano cztery etapy apoptozy: żywotne komórki o okrągłych jądrach emitujących zieloną fluorescencję; wczesne komórki apoptotyczne o zielonkawym wyglądzie demonstrujące kondensację chromatyny w kształcie rogalika na krawędziach nieregularnie ukształtowanych jąder; martwe komórki o żółtawo-pomarańczowym wyglądzie okrągłych jąder; oraz późne komórki apoptotyczne wykazujące skondensowaną lub sfragmentowaną chromatynę nieregularnie ukształtowanych jąder z żółto-pomarańczowym zabarwieniem.

Analiza wykazała znaczący wzrost średniej liczby komórek apoptotycznych (62,99%) w porównaniu z żywymi komórkami (37,1%) w linii komórkowej MCF-7, a w porównaniu z komórkami kontrolnymi stwierdzono istotną różnicę między średnimi komórkami apoptotycznymi z wartością p (0,0001). Wyniki te wskazują na apoptozę jako rodzaj śmierci komórkowej wywołanej w komórkach MCF-7 traktowanych pochodną (8).

Z drugiej strony, w linii komórkowej AMJ13 analiza ujawniła nieistotną liczbę komórek apoptotycznych z odsetkiem (23,6), i nie odnotowano istotnej różnicy między średnimi komórkami apoptotycznymi traktowanymi pochodną (8) a komórkami kontrolnymi (nieleczonymi). Większość komórek (23,6%) była albo martwa, albo w późnej apoptozie.

Analizy immunocytochemiczne z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych IgG1 skierowanych przeciwko kaspazie-3, kaspazie-9 i markerowi powierzchni komórkowej PECAM-1 wykazały znaczący wzrost kaspazy-3 (P-wartość 0,0082) i kaspazy-9 (P-wartość 0,0284) w komórkach MCF-7 traktowanych pochodną (8) w porównaniu do komórek normalnych. Dodatkowo, pochodna (8) spowodowała nieistotny wzrost PECAM-1 (CD-31) w porównaniu do nieleczonych komórek.

W linii komórkowej AMJ13 pochodna kaptoprilu (8) wywołała statystycznie istotny wzrost kaspazy-9 (p-wartość 0,0003), widoczny jako ciemnobrązowa pigmentacja wokół komórek, w porównaniu do bardzo lekkiej rozproszonej brązowej pigmentacji w komórkach kontrolnych. W przeciwieństwie do kaspazy-9, pochodna miała nieistotny wzrost kaspazy-3 i PECAM-1 w porównaniu do kontroli.

Czy stres oksydacyjny przyczynia się do cytotoksyczności?

Ocena aktywności indukującej ROS pochodnej przeprowadzona została w dwóch eksperymentach: jeden obejmował 72-godzinną inkubację komórek z różnymi stężeniami pochodnej (8) (IC₅₀, powyżej i poniżej IC₅₀), a drugi został wykonany poprzez traktowanie komórek stałym stężeniem (IC₅₀ pochodnej) w różnych odstępach czasu (2, 6 i 12 godzin).

W linii komórkowej MCF7, w pierwszym eksperymencie najwyższy poziom ROS osiągnięto przy najniższym stężeniu (25 µM), podczas gdy bazalny poziom ROS w MCF-7 został udokumentowany zarówno przy IC₅₀ (88,06 µM), jak i przy najwyższym stężeniu (250 µM). Z drugiej strony, drugi eksperyment udokumentował zależny od czasu wzrost poziomu ROS, osiągający maksimum po 12 godzinach inkubacji, co wskazuje, że poziom ROS stopniowo zmniejszał się, aby osiągnąć poziom bazalny po 72 godzinach. W linii komórkowej AMJ13 wyniki nie wykazały zmiany bazalnego poziomu ROS.

Jakie drogi śmierci komórkowej aktywuje pochodna?

W celu wyjaśnienia cytotoksyczności pochodnej (8), dalsze badania skupiły się na rodzaju śmierci komórkowej i potencjalnym mechanizmie działania wywieranym przez tę pochodną. Wyniki ujawniły zależne od komórki zachowanie pochodnej, gdzie w MCF-7 pochodna indukowała apoptotyczny typ śmierci z zaangażowaniem kaspazy-3, kaspazy-9 i generacją ROS. Z drugiej strony, wyraźny profil morfologiczny apoptozy był nieobecny w liniach komórkowych AMJ13, które wykazywały rozległy typ śmierci z tworzeniem wakuoli, bez generacji ROS, ale z istotnym zaangażowaniem kaspazy-9.

Można to wytłumaczyć faktem, że aktywność kaspazy-9 nie ogranicza się do apoptozy; kaspaza-9 jest zaangażowana w indukcję paraptozy (rodzaj programowanej nieapoptotycznej śmierci komórkowej indukującej wakuole). Liczne badania opisały pochodne tiosemikarbazydowe/tiosemikarbazonowe wykazujące kilka typów śmierci komórkowej, w tym apoptozę, śmierć podobną do mitozy, autofagię i paraptozę. A także wykazujące wiele typów śmierci komórkowej jednocześnie, takich jak apoptoza i autofagia.

Jak struktura chemiczna determinuje aktywność przeciwnowotworową?

Odrębny profil cytotoksyczności narzucony przez trzy pochodne można wyjaśnić na podstawie ich struktury chemicznej. Podstawienie przy fragmencie fenylowym jest niezbędne dla funkcji przeciwko rakowi piersi, gdzie grupa 4-metoksylowa pochodnej (8) wykazała najwyższe hamowanie proliferacji we wszystkich liniach komórkowych, podczas gdy chlor pochodnej (7) zniósł tę funkcję. Warto wspomnieć, że ta zależność struktura-aktywność (SAR) nie była nietypowa dla pochodnych tiosemikarbazydowych i została udokumentowana przez innych badaczy.

Ponadto, brak podstawienia pochodnej (5) może być specyficzny dla komórki, gdzie wywierała silny wpływ na receptor ER/PR ujemny AMJ13 z niewielkim wpływem, a nawet można powiedzieć, że nie wpływała na MCF-7 w porównaniu do komórek transformowanych. Aby to dalej wyjaśnić, obecność grupy elektronoakceptorowej w pozycji para-fenylowej prowadzi do utraty aktywności, jak pokazano w teście MTT. Tak więc dla hydrofobowej głowy niepodstawionej lub podstawionej grupą elektronodonorową było to istotne dla aktywności przeciwko liniom komórkowym raka piersi.

Warto wspomnieć, że te pochodne wykazały różne profile antyproliferacyjne, gdy testowano je w innych liniach komórkowych raka, w tym HCT-116, A549, HeLa i HepG2 (dane niepublikowane). Te badania potwierdziły, że pochodne są rzeczywiście wszechstronne i zachowują się w zależności od rodzaju zaangażowanych komórek.

Co warte odnotowania, badania dokowania molekularnego ujawniły pochodną jako potencjalny czynnik indukujący paraptozę poprzez celowanie w najważniejsze szlaki sygnałowe zaangażowane w ten proces (JNK1, p38 i MEK-2). Należy zauważyć, że nie jest to pierwszy przypadek, gdy pochodna tiosemikarbazydowa indukuje śmierć komórkową, która nie jest ani apoptotyczna, ani nekrotyczna, bez produkcji ROS. Cavazzoni i jego współpracownicy zaobserwowali to samo zachowanie swojej pochodnej tiosemikarbazonowej (określanej jako kompleks miedzi(II) 5). Hager i wsp. również udokumentowali parapotyczną śmierć komórkową ze swoim związkiem Me2NNMe2, który wywołał swoją cytotoksyczność niezależnie od generacji ROS, raczej było to związane ze zwiększonym poziomem utlenionej formy glutationu.

Czy pochodne kaptoprilu mogą stać się przyszłością terapii raka piersi?

Podsumowując, badanie to wykazało, że pochodna tiosemikarbazydowa kaptoprilu (8) jest bardzo obiecującą cząsteczką przeciwko liniom komórkowym raka piersi. Pochodna wykazała znacznie lepszą aktywność antyproliferacyjną niż kaptopril przeciwko obu liniom komórkowym: z dodatnim receptorem ER MCF-7 i wysoce agresywnym z ujemnym receptorem ER/PR komórkom raka piersi AMJ13. Pochodna powodowała śmierć apoptotyczną z potencjalnym zaangażowaniem kaspazy-3 i kaspazy-9 wraz z zależną od czasu generacją ROS w MCF-7, oraz rozległe tworzenie wakuoli, nieapoptotyczną śmierć komórkową, bez generacji ROS, ale z istotnym zaangażowaniem kaspazy-9 w AMJ13.

Niezależnie od tego, czy to zależne od komórki zachowanie pochodnej jest związane z odmiennymi cechami charakterystycznymi każdej linii komórkowej, czy też opiera się na jej wszechstronności celów, które mogą lub nie mogą obejmować komponenty RAS, pochodna okazała się obiecującym czynnikiem antyproliferacyjnym przeciwko komórkom raka piersi i z pewnością jest zalecana jako wiodąca cząsteczka w przyszłych badaniach.

Badanie to ma pewne ograniczenia. Mogło obejmować bardziej szczegółowe techniki dotyczące dwóch typów śmierci, takie jak Western blot, TEM, cytometria przepływowa. Brak dostępności tych technik w momencie rozpoczęcia badań znacznie ograniczył tę możliwość. Obecnie techniki te są dostępne i kolejne badania tych pochodnych będą obejmować te techniki.

Podsumowanie

Badania wykazały, że nowe pochodne tiosemikarbazydowe kaptoprilu, szczególnie pochodna oznaczona jako (8), mają znaczący potencjał w leczeniu raka piersi. Związek ten wykazał wyraźnie lepszą aktywność przeciwnowotworową niż oryginalny kaptopril, skutecznie hamując wzrost zarówno komórek raka piersi z dodatnim receptorem estrogenowym (MCF-7), jak i agresywnych komórek z ujemnym receptorem (AMJ13). Istotne jest, że pochodna (8) wykazała mniejszy wpływ na zdrowe komórki piersi. Mechanizm działania różnił się w zależności od typu komórek – w MCF-7 indukowała śmierć apoptotyczną poprzez aktywację kaspaz i generację wolnych rodników, podczas gdy w AMJ13 powodowała nieapoptotyczną śmierć komórkową z tworzeniem wakuoli. Struktura chemiczna, szczególnie obecność grupy 4-metoksylowej, okazała się kluczowa dla aktywności przeciwnowotworowej. Wyniki sugerują, że pochodna (8) może stanowić obiecującą podstawę do rozwoju nowych terapii przeciwko różnym typom raka piersi.